Процесс подготовки клеток для исследований методом жидкостной цитологии

Продукция компании TriPath

Данный материал представляет собой инструкцию по применению продукции компании TriPath при подготовке клеток для гинекологических исследований методом жидкостной цитологии. Специалисты CYTOVET используют ключевые моменты этой инструкции для проведения исследований методом жидкостной цитологии у животных.

Оригинал инструкции — http://cytovet.ru/download/manual_method-LBC.pdf

Назначение

Используется для диагностики in vitro.

Метод представляет собой процесс приготовления клеточных препаратов на жидкой основе. Он призван заменить традиционный метод приготовления микропрепаратов мазков по Папаниколау, применяющихся в скрининговых исследованиях для выявления рака шейки матки.

Средой для сбора и транспортировки гинекологических образцов, тестируемых в анализах амплифицированных ДНК BD ProbeTec™ Chlamydia trachomatis (CT) QI и Neisseria gonorrhoeae (NG) QI, является жидкий консервант SurePath® Preservative Fluid. Инструкция по использованию SurePath® Preservative Fluid для подготовки образцов, используемых в этих анализах, см. на листках-вкладышах в упаковках наборов для анализа.

Краткий обзор и описание

Скрининговое исследование для выявления рака шейки матки с использованием метода Папаниколау (Pap) включает микроскопическое исследование экто- и эндоцервикальных клеточных образцов, нанесённых на предметные стёкла и окрашенных по методу Папаниколау. Цервикальное цитологическое скрининговое исследование с помощью мазка по Папаниколау позволило сократить уровень смертности от инвазивной карциномы шейки матки на 50-70%. Поскольку цервикальное цитологическое исследование представляет собой скрининговое исследование, все обнаруженные патологии должны подтверждаться гистологическим исследованием.

Для точности диагноза по мазкам Папаниколау крайне важно соблюдать процедуры отбора и приготовления образцов. Для полной точности чрезвычайно важна рандомизация и равномерный отбор части образца. Традиционная процедура взятия мазка по Папаниколау не предусматривает перемешивания образца перед приготовлением микропрепарата. Поскольку клетки на устройстве для взятия проб погружены в слизь, те клетки, которые переносят на микропрепарат, могут не быть репрезентативной выборкой всех клеток взятого мазка. Клетки переносятся на предметное стекло в зависимости от того, в каком месте устройства для взятия проб они находились. Много клеток остаётся на устройстве для забора проб.

Неоднородность типичного образца цервикального мазка ведёт к тому, что мазки, приготовленные традиционным способом, трудно готовить, исследовать и интерпретировать. Часто большие области микропрепаратов, приготовленных традиционным способом, покрыты примесями, клетками воспаления и пластинами эпителиальных клеток, которые могут скрывать ценный диагностический материал. Кроме того, если мазок не зафиксирован немедленно после приготовления, клеточная морфология может исказиться по мере высыхания (воздушные артефакты).

Описываемый метод представляет собой метод для превращения жидкой суспензии взятого мазка цервикальных клеток в равномерно окрашенный гомогенный микропрепарат SurePath® без разрушения скоплений клеток, необходимых для диагностики. Процесс включает консервацию клеток, их рандомизацию, обогащение диагностического материала, пипетирование и осаждение для создания клеточного препарата. Полученный в результате этого процесса микропрепарат может использоваться для обычного цитологического скринингового исследования и категоризации по классификации Бетесда.

Принципы методики

Метод жидкостной цитологии представляет собой процесс приготовления клеточных препаратов цервикальных клеток на жидкой основе.

Гинекологические образцы собираются квалифицированным медицинским персоналом с помощью приспособления типа «метёлка» (например, Cervex Brush®) или эндоцервикального комбинированного устройства типа щёточки-шпателя (например, Cytobrush® Plus GT или Pap Perfect® компании MedScand (USA) Inc.) со съёмными головками. Головку устройства снимают с ручки и помещают во флакон с жидким консервантом SurePath® Preservative Fluid. Флакон закрывают пробкой, прикрепляют этикетку и отправляют в сопровождении соответствующих  документов в лабораторию для обработки.

Cytobrush Plus

Щёточка-шпатель Cytobrush Plus.

В лаборатории законсервированный образец перемешивают путём встряхивания, а затем переносят в пробирку с PrepStain® Density Reagent (плотным реагентом). Стадия обогащения, состоящая из осаждения препарата на центрифуге через плотный реагент, частично удаляет из препарата ненужные для диагностики примеси и избыточные клетки воспаления. После центрифугирования пробирку с обогащённым клеточным компонентом восстанавливают деионизированной водой, и клеточный материал ресуспендируют с помощью пипеточного дозатора путём последовательного отбора и выпуска жидкости. Затем материал образца переносится в PrepStain® Settling Chamber (осадочную камеру), помещённую на предметное стекло SurePath® PreCoat. Клетки осаждаются под действием силы тяжести в течение короткого периода инкубации. Избыточный материал сливают. Микропрепарат SurePath® PreCoat окрашивают, осветляют и накрывают покровным стеклом. Клетки располагаются в круге диаметром 13 мм. Микропрепарат изучается под микроскопом квалифицированным цитотехнологом или патологом, с учётом другой информации о пациенте.

Предметные стёкла PreCoat

Предметные стёкла PreCoat (SurePath® PreCoat Slides).

Ограничения

  • Гинекологические образцы для приготовления препаратов, получаемых с помощью ручного метода, должны собираться с помощью одобренного устройства типа «метёлка» в соответствии со стандартной процедурой взятия мазка, определённой производителем.
  • Приготовлением и исследованием препаратов TriPath Imaging®, Inc. на жидкой основе могут заниматься только лица, прошедшие обучение в компании TriPath  или иных организациях, уполномоченных компанией TriPath  на проведение подобного обучения.
  • Для обеспечения требуемой эффективности устройства следует использовать только материалы, поставляемые или рекомендуемые компанией TriPath Imaging®, Inc. Использованные материалы должны быть надлежащим образом утилизированы в соответствии с нормативами организации и действующим законодательством.
  • Все материалы предназначены для одноразового использования и не могут быть использованы повторно.
  • Для выполнения цитологического исследования SurePath® на жидкостной основе требуется 8,0±0,5 мл образца, собранного в SurePath® Preservative Fluid Collection Vial (флакон для забора мазка с жидким консервантом).

Предупреждения

  • Жидкий консервант SurePath® Preservative Fluid содержит водный раствор денатурированного этилового спирта и не предназначен для употребления внутрь. Смесь содержит небольшие доли метилового и изопропилового спиртов, которые при приёме внутрь могут быть опасны для здоровья и привести к слепоте.
  • Плотный реагент PrepStain® Density Reagent содержит азид натрия. Азид натрия может реагировать с медными и свинцовыми трубами, образуя высоковзрывчатые азиды металлов. При утилизации смойте большим количеством воды, чтобы предотвратить накопление азида.

Меры предосторожности

  • Следует соблюдать указания по надлежащей лабораторной практике, а также все процедуры, рекомендованные при использовании метода жидкостной цитологии.
  • Все реагенты стабильны до истечения указанного срока годности при условии соблюдения рекомендованных условий хранения.
  • Бактериальная контаминация реагентов может привести к неправильным результатам.
  • Замена предметных стёкол SurePath® PreCoat на другие может привести к неоптимальным результатам.
  • Избегайте расплёскивания и распыления жидкостей. Используйте соответствующие средства защиты рук и глаз, а также защитную одежду.
  • Жидкий консервант SurePath® Preservative Fluid обладает бактерицидным действием и был проверен на действие против следующих микробов: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Mycobacterium tuberculosis и Aspergillus niger. Однако следует постоянно соблюдать универсальные меры предосторожности по обращению с биологическими жидкостями.

Отбор дополнительной аликвоты

Во флаконе для забора мазка с жидким консервантом доступен объём, достаточный для отбора до 0,5 мл однородной смеси клеток и жидкости для дополнительного тестирования перед выполнением теста SurePath® Pap (теста по Папаниколау). Оставшийся после отбора объём достаточен для теста по Папаниколау.

Несмотря на отсутствие свидетельств о влиянии отбора аликвоты из флакона для забора мазка с жидким консервантом на качество образца для цитологического исследования, в редких случаях в ходе этого процесса возможно неравномерное распределение соответствующего диагностического материала. Если результаты исследования не соответствуют истории болезни пациента, медицинским работникам может потребоваться забор нового образца. Более того, цитологическое исследование решает клинические задачи, отличные от тестирования на заболевания, передающиеся половым путём (ЗППП), таким образом, отбор аликвоты может быть неприемлемым для некоторых клинических ситуаций. При необходимости можно отобрать отдельный образец для тестирования на ЗППП вместо отбора аликвоты из флакона для забора мазка с жидким консервантом.

При отборе аликвоты из образцов с низкой насыщенностью клетками в SurePath® Preservative Fluid Collection Vial может остаться объём материала, недостаточный для выполнения теста SurePath® Pap (теста по Папаниколау).

Аликвоту следует отбирать перед выполнением теста SurePath® Pap. Допускается отбор только одной аликвоты из флакона для забора мазка с жидким консервантом до выполнения теста по Папаниколау, независимо от объёма аликвоты.

Флакон для забора мазка с жидким консервантом

Флакон для забора мазка с жидким консервантом (SurePath® Preservative Fluid Collection Vial).

Методика

  1. Для обеспечения однородности смеси необходимо встряхивать флакон для забора мазка с жидким консервантом в течение 10-20 с. Затем в течение одной минуты следует отобрать аликвоту 0,5 мл.
  2. Наконечник пипетки для отбора аликвоты должен иметь аэрозольный барьер, а объём пипетки должен соответствовать объёму отбираемой аликвоты.
    Примечание. Не следует использовать серологические пипетки. Во избежание попадания загрязнений в SurePath® Preservative Fluid Collection Vial или в аликвоту необходимо соблюдать требования надлежащей лабораторной практики. Отбор аликвоты должен выполняться в соответствующем месте за пределами помещения, в котором выполняется амплификация.
  3. Визуально проверьте материал аликвоты в пипетке на наличие крупных твёрдых или полутвёрдых частиц. При обнаружении таких примесей в ходе забора аликвоты следует немедленно вернуть всю отобранную жидкость во флакон с образцом и отбраковать образец для дополнительного тестирования перед тестом по Папаниколау.
  4. Инструкции по обработке аликвоты в анализах амплифицированных ДНК BD ProbeTec™ CT QI и GC QI см. на листках-вкладышах в упаковках наборов для анализа, предоставленных их производителями.

Необходимые материалы

Предоставляемые материалы

  • SurePath® Preservative Fluid Collection Vial (флакон для забора мазка с жидким консервантом)
  • PrepStain® Density Reagent (плотный реагент)
  • PrepStain® Settling Chambers (осадочные камеры)
  • SurePath® PreCoat Slides (предметные стёкла PreCoat)
  • Центрифужные пробирки
  • PrepStain® Syringing Pipettes (шприц-пипетки)
  • Наконечники аспиратора

Необходимые, но не предоставляемые материалы

  • Центрифуга
  • Штативы для микропрепаратов
  • Модульный аспиратор (необязательно)
  • Лоток для обработки (необязательно)
  • Приспособление типа «метёлка» или эндоцервикальное комбинированное устройство типа щёточки-шпателя со съёмной головкой (головками) для взятия мазка
  • Устройство для встряхивания
  • Точные пипетки со съёмными наконечниками
  • Деионизированная вода (pH 7,5-8,5)
  • Изопропиловый спирт и химически чистый этиловый спирт
  • Реагенты для окрашивания
  • Осветляющее средство, среда для заливки и покровные стёкла

Хранение

  • Жидкий консервант SurePath® Preservative Fluid без цитологических образцов может храниться при комнатной температуре (от 15 до 30 ºС) до 36 месяцев со дня изготовления.
  • Срок хранения SurePath® Preservative Fluid с цитологическими образцами — до 6 месяцев в холодильнике (от 2 до 10 ºС) или 4 недели при комнатной температуре (от 15 до 30 ºС).
  • SurePath® Preservative Fluid, содержащий цитологический образец для использования в анализах амплифицированных ДНК BD ProbeTec™ CT QI и GC QI может храниться и транспортироваться до 30 дней при температуре от 2 до 30 ºС перед переносом в пробирки для разбавления образца с целью проведения цитологических исследований на жидкостной основе анализах амплифицированных ДНК BD ProbeTec™ QI.

Процедуры

  1. После взятия мазка с помощью Cervex-Brush® компании Rovers или аналогичного устройства для взятия мазка снимите головку устройства с ручки и поместите во флакон с жидким консервантом. Закройте флакон пробкой, прикрепите этикетку и отправьте в лабораторию.
  2. После регистрации флаконов с образцами в лаборатории поместите каждый флакон в штатив для обработки в комплекте с маркированной центрифужной пробиркой, в которую заранее помещено 4 мл плотного реагента PrepStain® Density Reagent и маркированного SurePath® PreCoat Slides (микропрепарата PreCoat). Плотный реагент следует добавить в пробирку до того, как туда будет добавлен образец, иначе качество процедуры снизится.
  3. Энергично встряхните каждый флакон с образцом в течение 10-20 секунд.
    (Во флаконе для забора мазка с жидким консервантом доступен объём, достаточный для отбора до 0,5 мл однородной смеси клеток и жидкости для дополнительного тестирования. Оставшийся после отбора объём достаточен для теста по Папаниколау. Отбор аликвоты может производиться после встряхивания в ходе теста с жидким консервантом SurePath®.)
    — Перенесите образец с помощью дополнительного автоматического устройства PrepMate™ Automated Accessory и шприц-пипеток PrepStain® Syringing Pipettes. См. инструкции в руководстве по эксплуатации устройств PrepMate.
  4. Поместите пробирки в штативы центрифуги в порядке, указанном на диаграмме последовательности расположения в руководстве по эксплуатации (каждый штатив вмешает до 12 пробирок). Последовательность размещения пробирок очень важна. Должен соблюдаться баланс.
  5. При необходимости сбалансируйте центрифужные пробирки добавлением консервирующей жидкости и центрифугируйте образцы в течение 2 минут при 200 g.
  6. При использовании модульного аспиратора включите систему Easy Aspirator и установите давление 230±50 мм рт. ст. Наденьте на аспиратор системы Easy Aspirator чистые наконечники.
  7. Извлеките штативы центрифужных пробирок из центрифуги. Медленно опустите наконечники системы Easy Aspirator (или одноразовые пипетки для переноса) в центрифужные пробирки для удаления надосадочной фракции. По завершении устройство аспирации должно касаться верха пробирки. Между образцами промывайте наконечники аспиратора водой.
  8. Центрифугируйте пробирки в течение 10 минут при 800 g, чтобы сконцентрировать диагностический компонент в клеточный осадок на дне пробирки.
  9. Извлеките штатив с пробирками из центрифуги. Осторожно и быстро слейте жидкость в раковину. Держа штатив перевёрнутым, осторожно промокните пробирки фильтровальной бумагой так, чтобы клеточный осадок остался в пробирке.
  10. Пометьте предметное стекло PreCoat номером каждого образца, стараясь не касаться поверхности стекла. Поместите предметные стёкла в штатив и установите на каждое предметное стекло осадочную камеру. Положение каждого нумерованного предметного стекла PreCoat должно соответствовать положению соответствующей центрифужной пробирки.
  11. Добавьте 4 мл буферной деионизированной воды (pH 7,5-8,0) в каждую пробирку и хорошо перемешайте встряхиванием.
  12. Обрабатывая пробирки с образцами по одной, перемешивайте их встряхиванием и немедленно перенесите 800 мкл клеточной суспензии в соответственно пронумерованную осадочную камеру на предметном стекле PreCoat. Повторите операцию для каждого образца.
  13. Подождите 10 минут, чтобы произошло полное осаждение. После осаждения осторожно переверните лотки с предметными стёклами над раковиной, чтобы слить оставшуюся жидкость, и промокните лишнюю жидкость фильтровальной бумагой.
  14. Промойте каждую осадочную камеру 500 мкл денатурированного этилового спирта слейте жидкость. Повторите промывание спиртом, слейте лишнюю жидкость и промокните фильтровальной бумагой, держа образцы перевёрнутыми не менее 1 минуты.
  15. Удалите осадочную камеру.
  16. Окрасьте микропрепараты SurePath® и закройте их покровными стёклами.

Результаты и интерпретация

  • К препаратам на жидкой основе, приготовленным по методу компании TriPath Imaging®, Inc., можно применять все диагностические критерии, применяемые в настоящее время в цитологических лабораториях для традиционных мазков по Папаниколау.
  • Любые патологические или сомнительные явления, обнаруженные при скрининговом исследовании, должны быть направлены патологу для ознакомления и диагноза. Любые мофологические изменения клеток важны и должны быть отмечены.
Поделиться: 

Комментарии

Чтобы иметь возможность оставлять комментарии, вы должны войти.